中药不再神秘:iTRAQ解密川芎嗪对神经退行性疾病的作用机制

在世界范围内,神经退行性疾病的发病率和死亡率均居于较高水平,一些研究已经证实川穹嗪(tetramethylpyrazine, TMP)对神经退行性疾病有效,该疗效是通过抑制小胶质细胞对炎症刺激的活化而实现的。但是,TMP作用的分子机制仍然未知。

重庆医科大学的研究人员在近期的研究中,利用蛋白质组学技术从新的角度阐释了TMP的做用机制:研究人员利用iTRAQ技术和 LC TRIPLE-TOF对经过或不经过TMP处理的脂多糖激活的小胶质细胞进行了蛋白质组学分析,鉴定出了5184种蛋白,其中266种具有差异表达,蛋白注释显示了差异蛋白包括iNOS、ERO1L等和降低细胞氧化应激反应相关的蛋白,进一步的Pathway分析表明,差异蛋白主要分布在包括LXR/RXR活化、NO产生等信号通路中。再次基础上,研究人员利用Western-blot进一步验证了iNOS蛋白的差异表达。

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该研究进一步表明,iTRAQ技术应用于TMP抑制小胶质细胞活性的分子机制研究是有效的,TMP降低了LXR/RXR介导的iNOS,并由此减少了炎症刺激下小胶质细胞的活化。

         

知识补充:川芎嗪简介

        川芎嗪是从中药川芎中分离的一种生物碱,即四甲基吡嗪。无色针状结晶,具有特殊异臭,有吸湿性,易升华。存在于伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.根茎、姜科植物温莪术(郁金)Curcuma aromatica Salisb.根茎、大戟科植物痛风麻疯树Jatropha podagrica Hook.茎。为治疗血栓等疾病的一种新型药物.有对抗肾上腺素和氯化钾引起家兔离体动脉收缩的作用。能明显增加冠脉流量,降低动脉压及冠脉阻力。有增进微循环的作用。能抑制ADP诱导的家兔体外血小板聚集,对大鼠静脉分路血栓有抑制作用。有神经节阻断和降压作用,并有抗菌作用,对革兰氏阳性菌有效而对革兰氏阴性菌无效。临床用于治疗缺血性脑血管病(包括脑血栓形成、脑栓塞等)和冠心病心绞痛取得较肯定的疗效。由于川芎中川芎嗪的含量甚低,仅千万分之几,提取分离工作量很大,故采用了人工合成的方法,日面已台成生产供药用。

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NGAL检测试剂盒的发现——诊断试剂盒研发小故事

肾脏是人体的重要器官,它的基本功能是生成尿液,借以清除体内代谢产物及某些废物、毒物,同时经重吸收功能保留水份及其他有用物质,如葡萄糖、蛋白质、氨基酸、钠离子、钾离子、碳酸氢钠等,以调节水、电解质平衡及维护酸碱平衡。

 

急性肾损伤(AKI)是一组临床综合征, 是指突发(1-7d内)和持续(>24h)的肾功能突然下降,定义为血清肌酐(SCr)至少上升0.5mg/dl 1,表现为氮质血症、水电解质和酸碱平衡以及全身各系统症状,可伴有少尿(<400ml/24h或17ml/h)或无尿(<100ml/24h)。

 

AKI是医院中常见的严重问题,流行病学研究AKI的发生率:

  •   5-7%入院患者
  • >30% ICU患者

AKI是一种高发病率、高死亡率的疾病,目前AKI诊断存在的限制

1)血清肌酐的变化受到多个因素的影响

  •   肾外因素:年龄、性别、体重、新陈代谢、药物作用
  •   机体水代谢

2)血清肌酐是较晚的指示剂

  •   血清肌酐达到一个平衡时,才能准确反应肾功能
  •   一般肾小球滤过率丢失50%以上时才发生变化;

3)尿量

  •     更易受到容量状态、药物等非肾性因素影响

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需要AKI的早期生物标志物,对AKI进行有效的干涉

故事转到辛辛那提儿童医院的Prasad Devarajan ,由于AKI急需早期的诊断标记,所以就着眼于发现新的早期诊断标记。

由于收集早期的AKI的病人样品比较困难,Devarajan教授一开始在大鼠和小鼠上做急性缺血性肾损伤模型(Ischemic Renal Injury)来模拟病人的急性肾损伤。收集了模型的肾组织以后提取RNA,并用microarry的方法分析其基因表达谱,结果发现NGAL基因的表达在肾损伤模型上很早就有高表达。幸运的是,NGAL蛋白在肾损伤早期的动物尿液中也有发现,因此它可以作为一个非常好的AKI早期诊断试剂。

2005年Devarajan教授在肾损伤病人中进行了研究,发现NGAL可以同样适用于人类。同年,Devarajan教授获得了该专利US7776824。后续Devarajan教授及其授权的合作者开发了NGAL检测试剂盒,并通过多项临床试验证明NGAL是一个非常优秀的AKI早期诊断标记物。目前已经完成或者在做的临床试验有110多项,这下临床试验发现NGAL可以被用于更广阔的检测目的。

Devarajan教授的幸运之处在于用microarray发现了一个在动物疾病模型早期转录的基因,这个基因编码的蛋白可以在尿液中被发现,而这个蛋白疾病标记的作用竟然在人类疾病中同样的有效。2003年还没有成熟的蛋白质组研究的方法,否则我相信Devarajan教授也会直接收集动物模型或者病人的尿液和血清,用iTRAQ方法进行检测。

这个故事提示我们对于早期诊断标记物的发现,动物模型还是非常重要,有过有很好的候选的标记物,非常值得进行后续的转化,在转化的过程中专利保护,临床试验等重要因素决定了项目的成败。

 

北京 邦菲生物 凭借多年在转化医学,生物学技术前沿和工业界的经验,希望帮助客户把临床和基础研究中的发现转化成业界认可的诊断检测试剂。

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挖掘胃癌细胞的分泌蛋白质组—GRN可能可以作为胃癌的诊断标记

胃癌是全球第四大肿瘤,第二大致死肿瘤。目前还没有非常有效的胃癌诊断标记物。

    这篇文章用2D-LC-MS/MS的方法结合iTRAQ标记,分析了两株胃癌细胞系的分泌蛋白谱。两株细胞系分别是来源于原位癌的AGS和来源于淋巴转移灶的MKN7。实验路线如下图,分别培养细胞,去掉血清进行条件培养并收集细胞裂解液或者培养基,用iTRAQ进行标记并进行2D-LC-MS/MS分析。

    结果发现在条件培养基中有90个蛋白的量高于全细胞裂解液。通过信号通路分析,exosome数据库分析发现这些蛋白中92.2%都是分泌蛋白。通过western,以及ELISA验证,发现GRN是在胃癌组织中表达,但是不在正常胃上皮细胞表达的蛋白;并且GRN在胃癌病人血清中的表达量比正常人群高。

    这一研究发现GRN可能可以作为胃癌的诊断标记。

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Reference List

Mining the Gastric Cancer Secretome: Identification of GRN as a Potential Diagnostic Marker for Early Gastric Cancer

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Identification of a Panel of Novel Serum Osteoarthritis Biomarkers

本文用iTRAQ的方法比较了50 个中度OA病人血清,50个严重病人血清和50个无症状的对照个体的血清的蛋白质组差异。结果发现了若干在早期OA和晚期OA的特异表达蛋白。


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该文的数据分析比较仔细,是值得借鉴的地方,此外分组采用的是10个样品一组,这样即降低成本又没有因为太多样品影响整个Pool的数据质量。
文章Journal of proteome research Impact Factor: 5.056
 
Reference
Patricia FP, Jesus M, Carolina FC (2011). Identification of a Panel of Novel Serum Osteoarthritis Biomarkers. Proteome Res. 10: 5095–5101