中药不再神秘:iTRAQ解密川芎嗪对神经退行性疾病的作用机制

在世界范围内,神经退行性疾病的发病率和死亡率均居于较高水平,一些研究已经证实川穹嗪(tetramethylpyrazine, TMP)对神经退行性疾病有效,该疗效是通过抑制小胶质细胞对炎症刺激的活化而实现的。但是,TMP作用的分子机制仍然未知。

重庆医科大学的研究人员在近期的研究中,利用蛋白质组学技术从新的角度阐释了TMP的做用机制:研究人员利用iTRAQ技术和 LC TRIPLE-TOF对经过或不经过TMP处理的脂多糖激活的小胶质细胞进行了蛋白质组学分析,鉴定出了5184种蛋白,其中266种具有差异表达,蛋白注释显示了差异蛋白包括iNOS、ERO1L等和降低细胞氧化应激反应相关的蛋白,进一步的Pathway分析表明,差异蛋白主要分布在包括LXR/RXR活化、NO产生等信号通路中。再次基础上,研究人员利用Western-blot进一步验证了iNOS蛋白的差异表达。

460

该研究进一步表明,iTRAQ技术应用于TMP抑制小胶质细胞活性的分子机制研究是有效的,TMP降低了LXR/RXR介导的iNOS,并由此减少了炎症刺激下小胶质细胞的活化。

         

知识补充:川芎嗪简介

        川芎嗪是从中药川芎中分离的一种生物碱,即四甲基吡嗪。无色针状结晶,具有特殊异臭,有吸湿性,易升华。存在于伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.根茎、姜科植物温莪术(郁金)Curcuma aromatica Salisb.根茎、大戟科植物痛风麻疯树Jatropha podagrica Hook.茎。为治疗血栓等疾病的一种新型药物.有对抗肾上腺素和氯化钾引起家兔离体动脉收缩的作用。能明显增加冠脉流量,降低动脉压及冠脉阻力。有增进微循环的作用。能抑制ADP诱导的家兔体外血小板聚集,对大鼠静脉分路血栓有抑制作用。有神经节阻断和降压作用,并有抗菌作用,对革兰氏阳性菌有效而对革兰氏阴性菌无效。临床用于治疗缺血性脑血管病(包括脑血栓形成、脑栓塞等)和冠心病心绞痛取得较肯定的疗效。由于川芎中川芎嗪的含量甚低,仅千万分之几,提取分离工作量很大,故采用了人工合成的方法,日面已台成生产供药用。

13

BBC:人类首张蛋白质组草图绘制完成

一个德国的团队和一个美国印度联合团队将他们的蛋白组图谱发表在了《自然》杂志上,他们的结果在公共网站上也可搜索到。

14

 

图1 蛋白(绿色)由中间的RNA(粉色)分子翻译所得,RNA则由我们的基因复制所得

他们首次试图建立起关乎每一个人的蛋白质数据库。这些结果基于我们对基因组的了解—我们知道何种基因在何种组织中生产蛋白质。

研究共报道了17,000至18,000种蛋白质。其中一些来自曾经认为是非编码的DNA片段。

在我们的每一个细胞中所包裹的超长DNA上,我们的基因只是其中的一部分,它包含用于生产蛋白质的指令和代码。

“虽然我们对基因组已经有了不错的了解,却还不知道这将近20,000个能用来编码的蛋白质基因中有多少能真正用以生产蛋白质。” 带领德国团队的慕尼黑工业大学Bernhard Kuester教授说。

 

意想不到的结果

 

为了找出答案,研究人员从人体组织的许多不同的样品以及一些细胞系中提取所有蛋白质。接着将这些纯化后的混合物中的蛋白切碎成小片段,利用质谱技术揭示组成每一个小片段的氨基酸序列。

凭借强大的计算资源及足够的耐心,我们可以将这一批蛋白质片段与人类基因组进行比较,从而制作图谱,以显示哪些组织中的哪些基因被“表达”而产生蛋白。

15

图2 为了将组成人体的所有蛋白进行编排,研究人员使用了一系列的样品,包括成体组织,胎儿组织和许多细胞系

“如果你喜欢这种说法,这是(人类蛋白质组的)第一份清单,” Kuester教授告诉BBC新闻记者,“就像十几年前人类基因组的初稿那样。”

并且正如人类基因组计划的结果一样,这些数据中包含了一些惊喜。

两组团队均发现了数百种意想不到的蛋白质,它们是由古基因(称为“伪基因”)片段或者那些根本不认为是基因的DNA片段产生。

除了这些蛋白质的新成员之外,还有一些明显的“缺席者”。“我们有充分的理由相信,数百个已知的,且已经被解析的基因,它们也许是多余的。” Kuester教授说。

美印团队,由美国巴尔的摩约翰霍普金斯大学教授AkhileshPandey领导。他们的研究找到了一些证据,证明从基因组中我们只能预测全部蛋白质的84%。

16

图3 超越遗传学

 

Pandey教授告诉BBC,研究蛋白质本身与研究编码它们的基因同样重要。

说到研究特定基因的研究者如何利用这个新数据库,他举了一个例子:“他们可以观察蛋白质的表达并且知道这个蛋白质的作用。比如说,如果一个蛋白质在胎儿肠道而非成人肠道中表达,那么他们或许应该考虑这个蛋白质可能参与了发育过程。”

组织依次分解的方法也可以帮助科学家们弄清药物的作用及副作用。通过比较不同癌细胞系的蛋白质组,Kuester教授和他的团队已经确定了一些蛋白质簇,这些蛋白质可以增强或减弱对癌症药物的敏感性。

Kevin Mills博士曾使用蛋白质组学研究了UCL儿童健康研究所的罕见病例,他认为在蛋白水平上观察“超基因组学”并观察它们如何变化非常重要。

“遗传学不能告诉我们一切,” Mills博士说道,他并没有参与上述两项研究。“这的确是非常重要的。我们并不是静止的——我们是不断变化的,我们的蛋白质组也在持续地变化着。”

他们在会议上看到过彼此的工作,但Pandey教授和Kuester教授告诉BBC新闻,他们并不知道会同时发表结果。上周,他们发现他们的工作将同时在《自然》的封面上闪亮登场时,彼此通了一个电话。

“我们从未把这当成是争夺冠军的竞赛,” Kuester教授说,“我的理解是,当时机成熟的时候,自然会有某个人去做。或许是某两个人!”

Pandey教授将如今的联合发表结果与人类基因组的初稿做了一个比较,那是2001年2月由两个不同的团队公布的。

17

图4 Pandey教授(中)和他的团队花了两年的时间生成并分析了这些数据

“虽然两个团队得到了类似的基因数目,但他们的基因列表是很不同的,”他说。“我们的结果在一致性上要好很多,不过把两份数据放在一起绝对是有益的。

12

Science: 中国蛋白质组计划投入4000万美元

中国科技部宣布启动一项4000万美元的科学研究项目,目标是绘制出健康和疾病状态下,包括心脏和肝脏在内的人类10个主要器官及组织的蛋白质组,以期构建出人体蛋白质百科全书。国际顶级科学期刊《科学》(Science)对这一消息持高度关注,并以“China pours money into proteins”为题进行了相关报道。

 

这一项目的监督主管、北京蛋白质组研究中心主任秦钧(Qin Jun)表示,探索人类蛋白质组是与绘制人类基因组图谱相当的又一庞大科技工程。基因组提供的是“生命的密码”,而蛋白质则负责执行生命的指令。“蛋白质是细胞的功能执行者,相比基因组它与疾病和人类功能更直接相关”,秦钧说。

 

尽管对于全球人类基因组计划中国的科研人员只贡献了1%的数据,秦钧希望中国能够在开展中的人类蛋白质组计划中发挥更重要的作用。人类蛋白质组计划是一项全球性的研究项目,在不久前即5月28日的《自然》(Nature)杂志上参与这一项目的国际研究小组公布了第一张人类蛋白质组草图。秦钧称,中国的目标是最终为这一国际合作项目贡献“至少30%的数据”。

 

北京基因组研究中心首席科学家贺福初(He Fuchu)表示:“中国已为大型数据和生物信息学时代来临做好了充分的准备。”贺福初领导的这一大型蛋白质组项目将历时3-5年,全国40个实验室的大约200名研究人员参与其中。

 

当前两大主要的研究机构正在北京建造之中。命名凤凰工程(PHOENIX)的国家蛋白质科学基础设施北京基地将拥有25台质谱仪,具有每天完成对10个蛋白质组进行测序的能力,其计划与2015年中尽早投入使用。明年国家生物医学大型数据中心也有望开放使用。

 

11
10

NGAL检测试剂盒的发现——诊断试剂盒研发小故事

肾脏是人体的重要器官,它的基本功能是生成尿液,借以清除体内代谢产物及某些废物、毒物,同时经重吸收功能保留水份及其他有用物质,如葡萄糖、蛋白质、氨基酸、钠离子、钾离子、碳酸氢钠等,以调节水、电解质平衡及维护酸碱平衡。

 

急性肾损伤(AKI)是一组临床综合征, 是指突发(1-7d内)和持续(>24h)的肾功能突然下降,定义为血清肌酐(SCr)至少上升0.5mg/dl 1,表现为氮质血症、水电解质和酸碱平衡以及全身各系统症状,可伴有少尿(<400ml/24h或17ml/h)或无尿(<100ml/24h)。

 

AKI是医院中常见的严重问题,流行病学研究AKI的发生率:

  •   5-7%入院患者
  • >30% ICU患者

AKI是一种高发病率、高死亡率的疾病,目前AKI诊断存在的限制

1)血清肌酐的变化受到多个因素的影响

  •   肾外因素:年龄、性别、体重、新陈代谢、药物作用
  •   机体水代谢

2)血清肌酐是较晚的指示剂

  •   血清肌酐达到一个平衡时,才能准确反应肾功能
  •   一般肾小球滤过率丢失50%以上时才发生变化;

3)尿量

  •     更易受到容量状态、药物等非肾性因素影响

9

 

需要AKI的早期生物标志物,对AKI进行有效的干涉

故事转到辛辛那提儿童医院的Prasad Devarajan ,由于AKI急需早期的诊断标记,所以就着眼于发现新的早期诊断标记。

由于收集早期的AKI的病人样品比较困难,Devarajan教授一开始在大鼠和小鼠上做急性缺血性肾损伤模型(Ischemic Renal Injury)来模拟病人的急性肾损伤。收集了模型的肾组织以后提取RNA,并用microarry的方法分析其基因表达谱,结果发现NGAL基因的表达在肾损伤模型上很早就有高表达。幸运的是,NGAL蛋白在肾损伤早期的动物尿液中也有发现,因此它可以作为一个非常好的AKI早期诊断试剂。

2005年Devarajan教授在肾损伤病人中进行了研究,发现NGAL可以同样适用于人类。同年,Devarajan教授获得了该专利US7776824。后续Devarajan教授及其授权的合作者开发了NGAL检测试剂盒,并通过多项临床试验证明NGAL是一个非常优秀的AKI早期诊断标记物。目前已经完成或者在做的临床试验有110多项,这下临床试验发现NGAL可以被用于更广阔的检测目的。

Devarajan教授的幸运之处在于用microarray发现了一个在动物疾病模型早期转录的基因,这个基因编码的蛋白可以在尿液中被发现,而这个蛋白疾病标记的作用竟然在人类疾病中同样的有效。2003年还没有成熟的蛋白质组研究的方法,否则我相信Devarajan教授也会直接收集动物模型或者病人的尿液和血清,用iTRAQ方法进行检测。

这个故事提示我们对于早期诊断标记物的发现,动物模型还是非常重要,有过有很好的候选的标记物,非常值得进行后续的转化,在转化的过程中专利保护,临床试验等重要因素决定了项目的成败。

 

北京 邦菲生物 凭借多年在转化医学,生物学技术前沿和工业界的经验,希望帮助客户把临床和基础研究中的发现转化成业界认可的诊断检测试剂。