134291 (1)

挖掘胃癌细胞的分泌蛋白质组—GRN可能可以作为胃癌的诊断标记

胃癌是全球第四大肿瘤,第二大致死肿瘤。目前还没有非常有效的胃癌诊断标记物。

    这篇文章用2D-LC-MS/MS的方法结合iTRAQ标记,分析了两株胃癌细胞系的分泌蛋白谱。两株细胞系分别是来源于原位癌的AGS和来源于淋巴转移灶的MKN7。实验路线如下图,分别培养细胞,去掉血清进行条件培养并收集细胞裂解液或者培养基,用iTRAQ进行标记并进行2D-LC-MS/MS分析。

    结果发现在条件培养基中有90个蛋白的量高于全细胞裂解液。通过信号通路分析,exosome数据库分析发现这些蛋白中92.2%都是分泌蛋白。通过western,以及ELISA验证,发现GRN是在胃癌组织中表达,但是不在正常胃上皮细胞表达的蛋白;并且GRN在胃癌病人血清中的表达量比正常人群高。

    这一研究发现GRN可能可以作为胃癌的诊断标记。

134291 (1)

 

Reference List

Mining the Gastric Cancer Secretome: Identification of GRN as a Potential Diagnostic Marker for Early Gastric Cancer

6608269392097687529

Identification of a Panel of Novel Serum Osteoarthritis Biomarkers

本文用iTRAQ的方法比较了50 个中度OA病人血清,50个严重病人血清和50个无症状的对照个体的血清的蛋白质组差异。结果发现了若干在早期OA和晚期OA的特异表达蛋白。


 6608269392097687529


该文的数据分析比较仔细,是值得借鉴的地方,此外分组采用的是10个样品一组,这样即降低成本又没有因为太多样品影响整个Pool的数据质量。
文章Journal of proteome research Impact Factor: 5.056
 
Reference
Patricia FP, Jesus M, Carolina FC (2011). Identification of a Panel of Novel Serum Osteoarthritis Biomarkers. Proteome Res. 10: 5095–5101
829788231443710366

Differential proteomic analysis of synovial fluid from rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients

   这一篇是小编比较感兴趣的文章,小编以前曾经收集过OA和RA的关节液,他们对破骨细胞的诱导分化有明显不同的作用,与小编之前的假设相反,有些OA对Osteoclast的诱导更明显。可惜当时没有iTRAQ来分析其差异。这篇文章比较了10个RA和10个OA病人的关节液的差异,技术路线如下图:

829788231443710366

  作者通过比较OA和RA的关节液的差异发现了一些新的蛋白。可惜没有进一步的验证以及讨论起对于关节的破坏作用,这是一个很好的开始,可以继续深入开展很多工作。

Reference 

Balakrishnan et al. (2014). Differential proteomic analysis of synovial fluid from rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients. Clinical Proteomics 11:1.

iTRAQ常见问题

1. iTRAQ技术原理是什么?

多个(每组最多8个)来源不同的蛋白样品经过不同标签标记后,可以合并后同时进行质谱分析。在每个肽段二级质谱图上,相应每个样品的报告离子强度用以表征该蛋白在不同样品中相对含量的高低,而肽段碎片离子可用于蛋白的鉴定分析。是鉴定与定量同时进行的一种定量技术。

2. 关于“样品重复”,技术重复和上机重复有什么区别?

“样品重复”,也可以称为生物重复。生物重复是指样品来自同一处理组的不同样品,是整个实验的完全重复,如平行培养的细胞或细胞株。技术重复是指对同一生物样品进行重复实验,可降低实验中的测量误差或背景噪音。上机重复是指是指同一样品进行重复上机检测。如下图:

sjcf-300x80 (1)

具体可参考文献:Chee Sian Gan, PohKuan Chong, et alTechnical, Experimental, and Biological Variations in Isobaric Tags for Relatives and Absolute Quantitation (iTRAQ). Journal of Proteome Research. 2007; 6(2): 821-827.

 

3. 不同老师的样本做iTRAQ定量可否放在一组上机?

不能。因为即使是同一个物种的样品,经过不同实验室处理后,里面蛋白含量和数目会有较大差别,混在一起后会影响两组不同来源的样品的蛋白鉴定数目。而对于来自不同物种的样品,信息分析的数据库选择会不同,无法进行比较。

4. 为什么有些差异表达基因在蛋白层面没有相应的差异蛋白?

从生物学角度看,由于miRNA调控、蛋白降解、蛋白分泌、转录和翻译效率不一致等原因,导致蛋白水平和转录水平未必呈现一样的趋势,这是正常现象。如果这些差异基因恰恰是老师感兴趣的,我们建议针对这些目标蛋白用MRM方法做一下“目标蛋白分析”,如果老师已有相关的研究基础,也可以用抗体的方法验证。因为当我们的研究视角落到一定范围内的时候,高通量的结果也需要进一步的仔细验证。

iTRAQTM试剂和AB SCIEX MALDI-TOF/TOFTM在磷酸化修饰分析中的应用

蛋白质磷酸化作为蛋白翻译后修饰方式的一种,在细胞功能的调节过程中发挥着重要作用。研究蛋白质的磷酸化机制,有助于科学家对信号转导途径,疾病的分子机理以及新型激酶抑制剂的开发等有更深 入的了解。由于蛋白质磷酸化的丰度低,大量非磷酸化肽段的信号抑制了磷酸化肽段的信号,所以常常需要对磷酸化蛋白质或肽段富集后再进行质谱鉴定。MALDI-TOF-MS与碱性磷酸酶的去磷酸化作用相结合可以鉴定磷酸化肽段。

1.1 样品制备

分别采集12例肝癌病人和12例健康人血浆,经2000g离心5分钟后收集血清。10 μL血清样本用 50%ACN,0.1%TFA稀释10倍,加入10 μl偶联金属的硅胶溶液(30%ACN/0.1%TFA)震荡30分钟,25000g离心5分钟,去上清。依次用50 μl 50% ACN/0.1%TFA/200 mM NaCl,30 μl 30%ACN/ 0.1%TFA溶液清洗捕获磷酸肽的硅胶颗粒,最后加入30μl 10%氨水在超声条件下洗脱10分钟,25000g离心5分钟,收集上清即为磷酸化肽段。或者在用ITRAQ试剂标记前,将5份肝癌患者的血清混合为一个样品,同样将5份健康人血清混合成一个样品。取混合后的样品用iTRAQTM溶解缓冲液(50 mM碳 酸氢三乙铵缓冲液,pH 8.5)稀释10倍,然后分别用iTRAQTM试剂114和117标记肝癌患者血清和健康人血清,室温反应1hr。之后把2个标记好的样品加入10μL 5%的TFA终止反应。最后将两个样品混合,通过固定化金属离子亲和色谱富集磷酸化肽段。

1.2 数据采集与处理

用AB SCIEX MALDI-TOF/TOFTM质谱仪自动采集数据,每个MALDI点采集15个母离子做二级,利用空气为碰撞气体,碰撞能量为1 KV。ProteinPilotTM4.0软件分析数据,利用Mascot进行数据库检索。 ProteinPilotTM 4.0软件计算每个iTRAQTM试剂的报告离子簇面积,并给出结果。

1.3 结果与讨论

为了验证MALDI-TOF检测磷酸化肽段的灵敏度,我们在血清中添加不同浓度(50, 20, 10, and 5 fmol)的磷酸化多肽标准品pY(RRLIEDAE[pY]AARG),经固定化金属离子亲和色谱富集,与基质混合后上机分析,结果显示5fmol的样品仍然可以检测到。

图23. 碱性磷酸酶处理后的磷酸化肽段的MALDI-TOF图谱 图24. 血清中添加磷酸化多肽标准品的MALDI-TOF结果 a)经碱性磷酸酶处理前 b)经碱性磷酸酶处理后

图25. 血清样本经iTRAQTM标记后MALDI-TOF MS/MS分析结果

用iTRAQTM试剂标记样品后分析,发现肝癌病人血清中的磷酸化多肽相比健康人表达量存在明显差异,图25所示多肽在癌症患者中表达量明显下降(Ratio 114/117=0.15),序列分析显示该多肽是Fibrinogen蛋白的片段。

小结:通过MALDI-TOF/TOFTM对血清中的磷酸化肽段进行了分析,结果表明5fmol的磷酸化肽段经固定化金属离子亲和色谱富集后仍可检测到。进一步结合iTRAQTM试剂对肝癌病人中的磷酸化蛋白进行了鉴定和定量分析。发现在肝癌病人血清中存在多个磷酸化肽段与健康人相比表达量存在明显差异,而且这几个肽段均来自于同一个蛋白:Fibrinogen,可能是由于癌症病人血清中蛋白酶,激酶以及磷酸化酶等的活性存在差异造成的。其中磷酸化的Fibrinogen peptide A(FPA)在癌症病人血清中表达量相比健康人血清明显下降。据报道Fibrinogen作为磷酸化蛋白,在一些疾病中磷酸化程度会达到70%以上,但在肝癌病人血清中存在FPA磷酸化程度下降还是首次发现。

脓毒症biomarkers研究

Identification of novel biomarkers for sepsis prognosis via urinary proteomic analysis using iTRAQ labeling and 2-D-LC-MS/MS

PLoS One. 2013;8(1):e54237. doi: 10.1371/journal.pone.0054237. Epub 2013 Jan 23

研究内容:

脓毒症可导致危重病人死亡,蛋白质组学的发展有助于了解重大疾病发展机理。本次研究通过iTRAQ技术研究30例脓毒症患者的尿液,寻找脓毒症早期预后的潜在biomarkers。

研究路线:

样本:取对照组(SI)、存活组(SP)和非存活组(de)病例各15例,分别采集尿液,pooled后提取蛋白。

技术:iTRAQ

研究结果:

  • 以30例不同阶段的脓毒症患者,以及15例对照组患者的尿液为样本,通过iTRAQ技术,共鉴定到232个蛋白。
  • 根据文中给出的“候选蛋白biomarker鉴定分析过程”,筛选出7个与早期预后相关的蛋白,5个呈现上调趋势(SELENBP-1, HSPG-2, A-1-BG, HPR, LCN),2个呈现下调趋势(LAMP-1, DPP-4)。
  • 在biomarker验证阶段,通过western blotting方法,以54例脓毒症患者尿液为样本,对3种蛋白进行验证(SELENBP-1, LAMP-1, HSPG-2)。证明蛋白LAMP-1可作为脓毒症早期预后评估的biomarker。