iTRAQ 技术采用4种或8种同位素编码的标签,通过特异性标记多肽的氨基基团,尔后进行串联质谱分析,可同时比较4种或8种不同样品中蛋白质的相对含量或绝对含量。

iTRAQ试剂是一种小分子同重元素化学物质,包括三部分:一端是报告部分 reporter group,另一端是肽反应部分 peptide reactive group,中间部分是平衡部分 balance group。

以4标为例其中: reporter group:质量为114Da、115 Da、116 Da、117 Da。

• peptide reactive group:将reporter group与肽N端及赖氨酸侧链连接,几乎可以标记样本中所有蛋白质。
• balance group:质量为31 Da、30 Da、29 Da、28 Da,使得四种iTRAQ试剂分子量均为145 Da,即等量异位标签(isobaric tag),保证iTRAQ标记的同一肽段m/z相同。

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将蛋白质裂解为肽段,然后用iTRAQ试剂进行差异标记。由于iTRAQ试剂是等量的,即不同同位素在标记同一多肽后在第一级质谱检测,分子量完全相同,用串联质谱方法对在第一级质谱检测到前体离子(precursor ion)进行碰撞诱导解离,产物离子通过第二级质谱进行分析。在二级质谱分析过程中,报告基团、质量平衡基团和多肽反应基团之间的键断裂,质量平衡基团丢失,产生低质荷比(m/z)的报告离子。由于二级质谱可分析相对分子质量相差1的报告基团,不同报告基团离子强度的差异就代表了它所标记的多肽的相对丰度。同时,多肽内的酰胺键断裂,形成一系列 b 离子和 y 离子,得到离子片段的质量数,通过数据库查询和比较,可以鉴定出相应的蛋白质前体。

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iTRAQ技术特点:

  • 分离能力强、分析范围广;
  • 定性分析结果可靠,可同时给出每一个组分的分子量和丰富的结构信息;
  • MS具备高灵敏度、检测限低;
  • 分析时间快,分离效果好;
  • 自动化程度高;
  • iTRAQ技术不仅可发现胞浆蛋白,还有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白。iTRAQ技术可检测出低丰度蛋白、强碱性蛋白、小于10KD或大于200KD的蛋白。

 

 

iTRAQ技术应用:

  • 非常高的通量, 同时标记8个样品,一次实验实现多达8个样品的蛋白质鉴定和定量;
  • 标记完全,标记效率高达97%以上 可减少样本处理、以及不同组上机造成的实验误差;
  • 可以进行多个时间点蛋白质组动态变化的监测;
  • 可以分析详细分期/型的临床疾病样本,并可设计样本重复,甚至可以进行个体样本的研究;
  • 可以研究细胞周期、细胞信号传导整个过程的蛋白质组动态学;
  • 适用范围广:无物种特异性限制,理论上可用于所有物种。

 

 

iTRAQ技术区别与以往二维电泳技术具有更明显的优势,两者比较如下:

  • 二维电泳所检测的发生表达变化的蛋白都位于细胞浆内,而iTRAQ可检测到蛋白有胞浆蛋白外,还有线粒体蛋白、膜蛋白和核蛋白;
  • 二维电泳观察到的蛋白变化在2倍以上,而用iTRAQ计算出的蛋白变化在1.3-1.6倍之间;
  • iTRAQ技术在鉴定大分子和小分子蛋白方面也有优势;
  • 二维电泳是通过切断条带,再用质谱方法测量条带中的蛋白质,但该方法既不是非常敏感,也不是非常精确,获取的信息量很少。 而itraq技术是基于高度敏感性和精确性的串联质谱方法,不需要凝胶,就可以获得相对和绝对定量的蛋白质结果;
  • iTRAQ可以对任何类型的蛋白质进行鉴定,包括高分子量蛋白质、酸性蛋白质和碱性蛋白质,而二维电泳对这些蛋白质都束手无策。  由此,邦菲生物得出结论:iTRAQ技术比二维电泳技术能发现更多数量和种类的蛋白,但在比较胞浆蛋白及蛋白量的变化方面,二维电泳技术有一定长处,对iTRAQ的实验结果有互补作用。